2. Identifikation der epigenetischen Signatur in AML durch Bestimmung der globalen Histonmodifikationsmuster in der AML.

PML-RARalpha ist ein Fusionsprotein, das aus der Translokation t(15;17)(q22;q11,2) entsteht. Es wird in allen Fällen von Akuter Promyelozytenleukämie (APL) gefunden. Histon-Modifizierungen wie z.B. Methylierung von Histon H3 an Lysin 4 und 9 oder die Azetylierung von Histon H3 sind mit dem transkriptionellen Aktivierungsstatus verbunden. Für t(15;17) wurde gezeigt, dass das Fusionsprotein PML-RARalpha Korepressoren wie Histondeacteylasen an das Chromatin rekrutiert.

PML-RARalpha-Homodimerisierung bindet die DNA weniger stringent als das nicht-mutierte RARalpha-Protein. Phänotypisch gesehen bedeutet das, dass PML-RARalpha die Differenzierung und die Apoptoseinduktion der Zellen inhibiert und dafür das Potential zur Selbsterneuerung erhöht.

Genomweite DNA-Proteininteraktionsscreenings wie „Chromatin-Immunopräzipitation on Chip“ (ChIP-Chip) haben das Verständnis für Zielgene der Transkriptionsfaktoren und Fusionsgene enorm bereichert. Zusätzlich kann diese Methode angewandt werden, um epigenetische Modifikationen wie Histon-Azetylierung an Promotoren zu identifizieren, die die Expression der relevanten Gene steuert.

Wir haben kürzlich in ChIP-Chip-Analysen 372 direkte Bindesequenzen für PML-RARalpha identifiziert. PML-RARalpha induziert Heterochromatinbildung an wahrscheinlich allen seinen Zielgenen. Viele der regulierten Gene sind als Tumorsuppressorgene bekannt. Für die neu entdeckten Gene wie S100P konnten wir eine Rolle im PML-RARalpha vermittelten Differenzierungsblock nachweisen. Einige der Zielgene konnten nicht nur in Zelllinien, sondern auch in primären leukämischen Blasten aus APL-Patienten nachgewiesen werden, was auf eine Rolle dieser Gene in der Akuten Promyelozytischen Leukämie hindeutet (Hoemme et al., Blood 2008).

 
 
 
 
Bei Bindung des Liganden Retiolsäure (RA) rekrutiert RARalpha Histonazetyltransferasen (HAT) an das Chromatin, was zur Aktivierung differenzierungsfördernder Gene führt. Das Fusionsprotein PML-RARalpha dagegen rekrutiert durch die Interaktion mit weitern Adapterproteinen Histondeazetylasen (HDACs) an das Chromatin, was die Differenzierung der Zellen verhindert, dafür aber Selbsterneuerung und Proliferation stimuliert.
PML-RARalpha assoziierte Änderungen in der Genexpression und daraus resultierende molekulare Funktionen. Globale Veränderungen in der mRNA-Expression bzgl. (A) PML-RARalpha Bindung, (B) Histon-H3-Azetylierung oder (C) Histon H3K9 Trimethylierung. Die Veränderungen in der mRNA-Expression wurden mit Affimetrix mRNA-Expressions-Arrays (GeneChip HG-U133A) in PML-RARalpha exprimierenden vs. nicht exprimierneden U937 Zellen untersucht. (A) Durch PML-RARalpha Bindung ist die Menge an Gesamt-RNA in den induzierten Zellen erniedrigt. (B) Gene mit verstärkter Histon H3 Azetylierung haben verstärkte Genexpression und umgekehrt. (C) Verstärkte H3K9-Trimethylierung geht mit transkriptioneller Repression einher. Innerhalb der Boxen liegen 50% der Datenpunkte, 75% aller Datenpunkte liegen innerhalb der Fehlerbalken. (D) Analyse der molekularen Funktionen der PML-RARalpha Zielgene. Signifikant regulierte Gene nach PML-RARalpha Bindung, Änderungen in der mRNA-Expression in PML-RARalpha exprimierenden U937 –Zellen und mRNA-Expressionsänderungen in murinen Promyelozyten (diese Daten wurden uns freundlicher Weise von T. Ley zur Verfügung gestellt) wurden auf Gemeinsamkeiten bzgl. ihrer molekularen Funktion hin untersucht. Dazu wurde die Ingenuity IPA Software 3.0 genutzt. Signifikant veränderte molekulare Funktionen (p< 0,05), die in allen 3 Datensets gefunden wurden, sind angezeigt.