Molekulare Therapieansätze in der AML

Die Akute Myeloische Leukämie (AML) ist durch die Infiltration des Knochenmarks durch unreife leukämische Zellen charakterisiert, die ihr intrinsisches Differenzierungsprogramm zu unterschiedlichen Zeitpunkten in der myeloischen Entwicklung unterbrochen haben. Stattdessen haben diese Zellen eine deutlich verlängerte Überlebenszeit, teilweise proliferieren sie und zeigen ein verzögertes kontrolliertes Absterben (Apoptose).

Eine AML ist nur schwer zu therapieren. Normalerweise wird die AML durch aggressive zytotoxische Medikamente behandelt, gefolgt von einer allogenen Knochenmarkstransplantation, sofern die Voraussetzungen des Patienten diese zulassen. Zunächst wird eine initiale Kombinationstherapie (Induktionstherapie) mit Anthrazyklinen und Cytarabine durchgeführt. Mit dieser Behandlung erreichen 60-80% der Patienten eine komplette klinische Remission, ein Stadium, in dem das Knochenmark Blasten-frei ist und die Zusammensetzung des Blutes wieder annähernd den „Gesund“-Zustand erreicht. Anschließend folgen Konsolidierungstherapien. Trotz dieser aggressiven Therapie erleiden viele Patienten einen Rückfall und versterben schließlich an der AML. Die Prognose der AML-Patienten ist nach wie vor unbefriedigend, das 5-Jahres-Überleben liegt für junge Patienten bei ca. 50%, für ältere Patienten bei weniger als 15%. Neue, weniger toxische Medikamente, die effizienter gegen die AML angehen, sind also dringend notwendig.

In den letzten Jahrzehnten sind große Fortschritte darin erzielt worden, die genetischen Hintergründe für die AML-Initiierung und deren Fortschreiten aufzuklären (Abb. 1A). Im Gegensatz zur chronischen Phase der CML (Chronische Myeloische Leukämie) haben die AML-Blasten schon mehrere transformierende Mutationen akkumuliert, wenn die AML klinisch sichtbar wird. Deshalb fokussiert unsere Gruppe ihre Arbeit v.a. auf die Identifizierung von veränderten Signalwegen, die für die leukämische Tranformation verantwortlich sein können und die ungeregelte Selbsterneuerung der Blasten verursachen. Als eine häufig vorkommende Mutation (ca. 30% aller AML) werden aktivierende Mutationen in der Rezeptortyrosinkinase Flt3 gefunden. Diese Mutationen beeinflussen die zelluläre Signaltransduktion sehr stark und wirken sowohl im Zellkultur- als auch im Mausmodell transformierend. Flt3 bietet sich also als therapeutisches Zielgen an. Mehrere Flt3- Kinaseinhibitoren sind in klinischer Testung. Kürzlich wurde auch die Rolle des Wnt-Signalweges in Selbsterneuerung und Proliferation von hämatopoetischen Stammzellen beschrieben. Auch in anderen Krebsarten ist eine Überaktivierung des Wnt-Signalweges als krebsfördernd beschrieben, und mehrere der nachgeschalteten Proteine des Wnt-Signalweges sind als Tumorsuppressorgene oder Protoonkogene bekannt.

Wir konnten kürzlich erstmalig zeigen, dass der Wnt-Signalweg auch in der AML mit chromosomalen Translokationen eine Rolle spielt. Außerdem zeigen unsere Daten, dass die Wnt-Signalkaskade an den transformierenden Ereignissen beteiligt ist, die zu den prominentesten unter den AML-verursachenden Mutationen gehören, nämlich der Flt3-ITD- Mutation. Dieser Signalleitungsweg scheint eine zentrale Signalintegrationsschnittstelle für die Aufrechterhaltung des hämatopoetischen Stammzellkompartiments zu sein. Momentan testen wir verschiedene Inhibitoren dieses Signalwegs, um den Effekt in der leukämischen Transformation zu untersuchen.

Ein anderer vielversprechender Therapieansatz ist der gezielte "Knock-Down" von Genen durch siRNA (small inhibitory RNA) innerhalb der Zellen, die zur Selbsterneuerung fähig sind.

Selbsterneuerung ist in der normalen Hämatopoese sehr wichtig, sie ist aber auch in Krebsstammzellen dysreguliert. Wir testen siRNA-Therapien in Kombination mit zusätzlichen Therapeutika (Flt-3 Kinasinhibitoren, Wnt-Signalwegsinhibitoren) oder Zytostatika. Man erhofft sich durch dies spezifische Ausschalten von Signalkaskaden zusammen mit Kombinationstherapien eine effizientere Bekämpfung der AML (Abb. 1B). Langfristig ist es von großer Wichtigkeit, die Relevanz unterschiedlicher Signalkaskaden in der Leukämieentstehung und deren potentielle Rolle als Angriffspunkt für Medikamente zu erforschen. Unser Grundverständnis für die leukämische Transformation wächst ständig, und so hoffen wir, darauf neue Therapiekonzepte aufbauen zu können. Der große Erfolg von ImatinibMeslyat, einem BCR-ABL-spezifischen Tyrosinkinaseinhibitor in der AML, schürt die Hoffnung, dass auch für die Behandlung der AML hochwirksame Medikamente gefunden werden.

Spezifische balancierte chromosomale Translokationen sind weitere prominente Aberrationen in der Leukämie. Eine der häufigsten Aberrationen in der AML (10-15% der Erwachsenen) ist die (t8;21)-Mutation. Sie führt zur Bildung des chimären AML1-ETO-Proteins. Durch diese Translokation ist der c-Terminus des Transkriptionsaktivators AML1 durch den transkriptionellen Repressor ETO ersetzt. Dadurch werden AML1-Zielgene reprimiert und es kommt zu einem Differenzierungsblock.

Unser Labor hat eine Strategie entwickelt, in der wir onkogene transkriptionelle Repressoren nutzen, um spezifisch den Zelltod in malignen Zellen zu induzieren. Wir nutzen AML1-ETO positive Zellen als Modellsystem und haben ein neues Fusionsprotein entwickelt, das aus der MYB-DNA-Bindedomäne und der AML-1 Bindedomäne des „myeloid elf-like factors“, MEF  besteht (M&M-Fusionsprotein; Abbildung 2). Wenn wir dieses Protein in leukämische Zellinien transfizieren, assoziiert es mit AML1-ETO. Der Multiproteinkomplex bindet dann an die myb-spezifischen Promotoren in vivo und in vitro.

In Anwesenheit von AML1-ETO werden die myb-responsiven Promotoren reprimiert. Dadurch wird Apoptose induziert und das Kolonienwachstum der Leukämiezellen im Zellkulturassay inhibiert. All diese Effekte treten spezifisch in AML1-ETO positiven Zellen auf; nicht-AML1-ETO positive Zellen bleiben unbeeinflusst (Abbildung 3).

Diese Studie zeigt, dass die Umlenkung von onkogenen Proteinen die zellulären Ereignisse dramatisch beeinflussen kann. Außerdem bietet sie die Möglichkeit, die Krebszellen spezifisch anzugreifen. Momentan entwerfen und testen wir weitere chimäre Fusionsproteine, um daraus neue Therapieansätze für Leukämien und solide Tumoren zu entwickeln.

 
 
 
 
(A) Ein Modell zur Entstehung von Leukämischen Stammzellen (LSC) geht davon aus, dass leukämische Stammzellen aus einem primitiven hämatopoetischen Vorläufer entstehen, der noch die Fähigkeit zur Selbsterneuerung hat. (B) Konventionelle Therapien für Leukämie sollen leukämische Blasen zustören. Diese Ansätze sind häufig nicht effizient genug, so dass die verbleibenden Leukämischen Stammzellen einen Wiederausbruch der Erkrankung zur Folge haben. Neue Therapien, die spezifisch die LSC angreifen, versprechen mehr Effizienz (Aus: Guzman et al,. 2004).
Antileukämische Aktivität eines chimären Proteins (M&M), das aus der MYB-DNA-Bindedomäne und der AML-Bindedomäne des MEF-Proteins besteht und das Fusionsprotein AML1-ETO an andere DNA-Elemente umlenkt. Ohne M&M (A) Aktivität werden MYB-abhängige Gene aktiviert und AML1-abhängige Gene reprimiert, was zum Differenzierungsblock und zur Akkumulation von AML-Blasten im Blut führt. In Anwesenheit von M&M (B) bindet das AML1-ETO-Fusionsprotein an MYB-spezifische Promotoren und reprimiert die dort regulierten Gene. Dies führt zur Wachstumsinhibition und Apoptose in den leukämischen Zellen.
GFP-M&M reprimiert das Kolonienwachstum in AML1-ETO exprimierenden Zellen. (A) 32D Zellen wurden mit pcDNA3.1 (Kontrollvektor) oder AML1-ETO zusammen mit M&M transfiziert. Die Kolonien wurden an Tag 10 photographiert. (B) Transfizierte 32D Zellen (wie in A) wurden für Koloniebildungsassays ausgesät. Man sieht eine starke Repression des Kolonienwachtsums im Vergleich mit den Kontroll-Transfektionen mit GEF-pcDNA3.1 (als 1 gesetzt).